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水产品兽药残留检测技术

作者:admin发布时间:2020-06-06 18:22

  水产物兽药残留检测本事_水产渔业_农林牧渔_专业材料。水产物兽药残留检测本事 廖修萌 闭键实质 ? 兽药残留概述 ? 前治理本事 ? 液质领悟残留手段的设立修设办法 ? 手段验证 ? 才智验证思绪和经

  水产物兽药残留检测本事 廖修萌 闭键实质 ? 兽药残留概述 ? 前治理本事 ? 液质领悟残留手段的设立修设办法 ? 手段验证 ? 才智验证思绪和体验 水产物兽药残留领悟概述 兽药残留(animal drug residues)是 指给动物利用药物后蓄积或储存正在 细胞、机闭或器官内的药物原形、 代谢产品和药物杂质。 水产物兽药残留领悟概述 农业部193号告示兽药禁用清单有21类, 蕴涵硝基呋喃类,孔雀石绿类,氯霉素类, 汞成品类等,出口水产物中心监测的兽药 还包扣磺胺类,喹诺酮类,大环内酯类, 青霉素类,四环素类等。出口指定的兽药 检测项目央浼不得检出。 水产物兽药残留领悟概述 兽药残留超标的闭键起因 1、不法利用犯禁药品 2、不遵照歇药期,《中邦兽药典》。 3、其他起因如饲料加工的交叉污染, 动物个别代谢区别等。 水产物兽药残留领悟概述 对兽药残留履行监控是一种杂乱的体例工程, 蕴涵从药物研制、注册挂号、临盆、利用及食物和 境遇监测等诸众闭键。设立修设残留领悟手段和制订最 高残留限量、歇药期是最基础的方面。 目前邦内颁发的法定检测手段还缺乏体例性和 完美性,其他危急性对照大,稀奇是出口欧盟产物 必必要检测的种类如抗甲状腺制剂、类固醇类、硝 基咪唑类药物、精神类药物、抗蠕虫药物、境遇污 染物等的检测手段尚正在探究之中。 2002年农业部再次对已宣布的兽药最高残留限 量轨范举办了修订并从头宣布,此次共规章了134 种兽药的《动物性食物中兽药最高残留限量轨范》。 跟着兽药科技的发达,新兽药种类还会陆续出 现,因而须要陆续地制订和修校阅在水产物的兽药最 高残留限量规章及相应的残留检测手段。 兽药残留检测概述 兽药残留检测 涉及到安闲性试 验手段,提取方 法,净化手段, 测定手段(分手方 法检测手段)。 兽药残留检测概述 1.文献检索 文献检索仅能显示最适宜的领悟手段可以是什么,供给样品治理, 分手和检测方面简陋新闻,举办手段的对照和模仿,调节详细的 试验条目,改革和设立修设契合央浼的新手段。如针对新对象或采用 新本事,能够从较早的化学合成文献获得待测物的物理性子或分 离方面的原始材料,或从具有左近组织或官能团化合物的手段方 法中得回某些新闻和提示。有现成轨范手段的采用现成轨范手段 (验证)。 2.设立修设测定手段 设立修设测定手段和线性规模,为后续的百般就业供给领悟手腕,最 后按照滋扰和利用情形逐渐确立测定条目和设立修设轨范弧线。如兽 残及代谢物属中等极性或较高极性化合物,不行直接举办GC领悟, HPLC常用的检测器有紫外(UVD),荧光(FLD,共轭双烯), 电化学(EehlD)。MS为特殊规检测器。 兽药残留检测概述 3.设立修设样品治理手段 提取,净化,衍生 4.轨范弧线 LC-MS/MS央浼设4个点,闭系系数大于0.995,有外标 (基质结婚法)和内标,轨范插手法,基质结婚法。 5.安闲性试验 大凡蕴涵轨范溶液(溶剂)和样品中储存条目下的稳 定性试验,如室温,冷冻,重复冷冻-解冻条目下的稳 定性。 6.手段评判 确凿度,紧密度,聪明度等。 水产物兽药残留检测样品前治理本事 样品治理手段涉及的身分许众,操作复 杂,手段活跃,直接影响各项领悟目标、 本钱和恶果,大凡占70%的领悟就业量。 水产物兽药残留检测样品前治理本事 1、提取溶剂的采用 常用的提取溶剂有乙腈,甲醇,丙酮,这些 溶剂与水,稀酸,稀碱的夹杂溶剂如乙腈-甲 醇,氯仿-甲醇,乙腈-水,或酸化,碱化等。 乙酸乙酯,氯仿,二氯甲烷,和叔丁基 甲醚。叔丁基甲醚可庖代卤代溶剂。 1、提取溶剂的采用 ? 乙腈,甲醇,丙酮与样品容易连合,溶剂化感化和 排泄才智强,粘度小,提取速率疾,能使连合态的 药物开释,提取的同时脱卵白脱脂,PH值可调,待 测物散布平均。但提取的杂质较众,进一步萃取乳 化重要,效益相像,甲醇提取液的杂质最高。“万 能溶剂”DMSO沸点高极少用。 ? 正在酯溶性的残留物中,采用非水溶性极性溶剂,乙 酸乙酯,氯仿,二氯甲烷,。 ? 加无水硫酸钠,盐析升高接受率。干样(含水小 10%)加水加强提取。 水产物兽药残留检测样品前治理本事 2、提取手段 ? 均浆提取法;惊动法;索氏提取法(推敲热 安闲性,适合水分少如饲料样品,水产物组 织要和海砂或无水硫酸钠一齐研磨成干粉); 超声波提取(SAE,空化感化,填补融解, 时光不行长,发烧);超临界流体萃取 (SFE),加强溶剂萃取(ASE)和微波辅 助萃取(MAE) 水产物兽药残留检测样品前治理本事 2、提取手段 ? 超临界流体密度与液体相像,不过溶质正在此中的扩 散系数比液体中大得众。 ? 极性低的碳氢化合物,醚,酯,环氧化合物,能够 正在低压力下提取(7-10MPa)举办萃取,羟基,羧 基难萃取,一个羧基和两个羟基的化合物和三个酚 羟基的苯环衍生物能够被萃取;40 MPa以下,糖和 氨基酸都不行被萃取;分级极性区别和挥发性区别。 水产物兽药残留检测样品前治理本事 2、提取手段 超临界流体萃取仪— 流体源,加压装备, 控温装备,萃取容器, 节约装备,征采装备。 CO2行动流体操作温 度低,利于热担心闲 的化合物,组分中不 含氧,提防氧化。 水产物兽药残留检测样品前治理本事 3、净化手段 液-液萃取LLE LLE使用待测组分与样品杂质正在互不相溶 的两相中融解性区别举办净化。策画的根底 为:极性组分与非极性组分;极性物质再分 成酸性,中性,碱性物质。正己烷(石油醚) -乙腈;正己烷-甲醇;正己烷-丙酮;异辛烷80%丙酮;氯仿-水;乙酸乙酯-水。 影响身分:溶剂,PH值(磺胺,喹诺酮,苯 并米唑类,苯乙胺类等) 水产物兽药残留检测样品前治理本事 3、净化手段 液-液萃取操作手段 分液漏斗惊动,漩涡萃取,逆流萃取,出格容器萃 取。 从水相中提取药物时溶剂中常带如少量的水分,可 滋扰固相萃取,延伸浓缩时光和填补杂质,加无水 硫酸钠脱水。高极性的药物正在净化中发作吸附,硅 烷化玻璃器皿(1%三甲基氯硅烷的甲苯溶液淌一 次,100℃下干燥30min);加异丙醇或二乙胺也 能消浸吸附。 水产物兽药残留检测样品前治理本事 3、净化手段 固相萃取(SPE) 采用固相萃取小柱行动分手前言,小柱中增添了不 同填料的固定相,以键合硅胶为基质的C18、NH2、 COOH、PSA、SAX等,是硅胶的外面活性大为降 低,最大水平的消浸了极性化合物的不成吸同意拖 尾,使样品接受率和重现性获得保证;以高分子聚 合物为基质的如PEP、HXN、PAX、PCX等,具 有高纯度、高比外面的特性;以吸附型填料为固定 相的如硅酸镁、氧化铝等,闭键通过外面的极性吸 附到达分手的主意。因而,固相萃取法合用于百般 极性的化合物 水产物兽药残留检测样品前治理本事 3、净化手段 固相萃取(SPE) 水产物兽药残留检测样品前治理本事 3、净化手段 固相萃取(SPE)操作办法:活化,上样,洗涤,洗脱。 其他手段 固相微萃取:固液吸附平均 制备色谱法:制备HPLC领悟激素残留 凝胶排泄色谱法:分子筛感化 膜分手本事:硝酸纤维,醋酸纤维等半透膜 基质固相聚集本事:样品和填料的比例是1:4 免疫亲和色谱:贯串有抗体的惰性基质做固定相,采用性吸附。 分子印迹本事:印迹群集物,塑料抗体 水产物兽药残留检测样品前治理本事 4、浓缩富集及再融解 回旋蒸发:溶剂可接受 气流吹蒸:少量溶剂 K-D浓缩器:浓缩,回流,洗涤,定容 真空离心:热敏性组分,浓厚液体 再融解利用活动相的初始比例作溶剂 设立修设液相色谱串联质谱定量领悟手段 办法 1.确立质谱条目 2.设立修设LC手段 3.内标采用 4.前治理手段采用 设立修设液质定量领悟手段 文献检索:知道化合物的性子蕴涵化合物的结 构、化合物的极性及化合物的pKa值。开始了 解化合物的组织,可可能的揣测其碎片离子的 断裂体例,采用较为安闲的碎片离子行动定量 的子离子,也能够按照体验推断选用哪种离子 源更为符合;按照化合物的极性巨细,能够选 择一种或几种妥善的溶剂行动溶媒,既能保障 十足将样品融解,又能升高化合物的质谱相应; 化合物的pKa值,有助于采用活动相的增添剂 及其pH值,从而升高质谱相应。 设立修设液质定量领悟手段 设立修设液质定量领悟手段 1、确立质谱条目(化合物优化) 1.贯串管途 2. 采用Q1MS扫描形式和Full Scan扫描类型 3. 修设离子源参数 4.将活动相导入质谱仪,考察到待测化合 物的准分子离子峰峰强度正在10的6次方左 右。 设立修设液质定量领悟手段 1、确立质谱条目(化合物优化) 5. 采用MS Only优化形式和Syringe Pump Infusion入口类 型选项 6.优化Tube Lens Offset、Spray Voltage、Sheath Gas Pressure、Aux Gas Pressure得回待测化合物安闲的准分 子离子峰。 7.采用MS+MS/MS优化形式修设Parent Mass、Charge State和Num Product对子离子举办优化。 8. MRM优化形式优化Tube Lens Offset和Collision Pressure 9.纪录并保管子离子全扫描质谱图。保管Tune Method文 件。 设立修设液质定量领悟手段 1、确立质谱条目(化合物优化) 设立修设液质定量领悟手段 1、确立质谱条目(化合物优化) 设立修设液质定量领悟手段 2、确立LC条目 ? 正在液相-紫外检测中,利用的增添剂的品种繁众,能够是挥 发性的酸或者碱(如甲酸、乙酸和氨水等),也能够是不 易挥发的缓冲盐(如磷酸二氢钠-磷酸缓冲液、磷酸二氢钾磷酸缓冲盐)。不过正在液质领悟中,基于质谱检测的道理, 咱们只可利用可挥发的酸碱或缓冲盐,那么品种就会受到 极大的范围。正在寻常领悟中利用到的增添剂闭键有甲酸、 乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸铵、乙酸铵等缓冲盐。三乙 胺正在紫外检测中,常行动收尾剂,不过正在液质检测中是绝 对禁止的。由于三乙胺进入质谱后不易肃清,残留及其厉 重,不妨遏抑离子的相应。 ? 正在液相色谱紫外检测中,央浼化合物之间R≥1.5,举办定量, 那R最好≥2.0,央浼确凿的配制活动相,切确的调好活动相 的pH及增添剂的浓度。但正在液质领悟中,咱们常常利用众 响应监测(MRM/SRM)对化合物举办定量,因为MRM要 求采用两次离子,因而它具有很高的专属性,基于这点我 们对众个化合物同时举办检测时,不须要相互间到达十足 分手就能够对他们举办定量领悟。 设立修设液质定量领悟手段 2、确立LC条目 ? 因为生物样品中含有大宗的基质,这些基质 的存正在会重要的滋扰和影响化合物的测定, 于是咱们须要使用色谱将化合物与基质隔离, 从而消浸基质效应的影响,即消浸离子遏抑。 ? 待测化合物要正在色谱柱上有保存,而且合意 延伸保存时光。三聚氰胺最好用离子柱。 设立修设液质定量领悟手段 3、内标采用 内标就业体例: ? 正在每个样品、轨范和空缺中插手 ? 测定到每个样品中内标的相应 ? 按照实践测定内标相应值与预期内标相应值的比值 来校正其他化合物的信号 ? 用领悟信号和内标的比作轨范弧线或乘校正因子或 除内标接受率 ? 计较未知样品的领悟信号和内标的比值并从轨范曲 线中读出信号 设立修设液质定量领悟手段 3、内标采用 1.样品中不存正在或者能够无视 2.没有受到质谱滋扰 3.没有对领悟对象出现质谱滋扰 4.谢绝易受到境遇污染 5.和领悟对象质地数亲切(氘代物) 6.离解体例和领悟对象亲切 才智验证体验及基质效应 为什么要采用LC-MS ? 观察化合物的含量越来越低 ? 基体越来越杂乱 ? 药残的才智验证创议的第一手段 比如: ? 干鱼粉中的恩诺沙星和环丙沙星 ? 鱼肉中的氟苯尼考 才智验证体验及基质效应 观察中的质地掌管手段 ? 掌管样品空缺 ? 平行双样测定或三样 ? 加标接受 ? 轨范参考物质的同步领悟 ? 反复测定和仪器比对 才智验证体验及基质效应 加标接受:可分为前治理加标接受和上机加 标(单点轨范插手) 才智验证体验及基质效应 加标接受:可分为前治理加标接受和上机加 标(单点轨范插手) ? 加标接受亲切100%不行代外观察结果十足 确凿无误 。 ? 不行检讨轨范物质自己所带来的偏差; ? 不行检讨加和性滋扰 ,如污染和质谱滋扰 ; 才智验证体验及基质效应 轨范参考物质的同步领悟 :采用基体和浓度 相像的轨范参考物质同步举办领悟 感化: ? 轨范是否及格 ? 样品前治理是否符合 ? 测定中是否存正在滋扰 ? 目前药残的轨范参考物质很难进货,对付固 体的邦度一级轨范物质,尽管不行购得,也 要尽量征采到证书。 才智验证体验及基质效应 其他质控手段 ? 差别仪器的比对试验 差别仪器正在必定水平可参观基体和质谱的干 扰状态 ? 反复领悟和职员比对试验 ? 尽量打消过失偏差和随机偏差 以上的质地掌管手段正在观察中应尽量众采用 才智验证体验及基质效应 观察前预备 ? 确认色谱柱柱效 ? 各活动相富足 ? 洗涤锥口 ? 从头调谐校正仪器 总之便是使仪器处于优良形态 才智验证体验及基质效应 预试验 ? 稀释到必定(或央浼)的倍数后测定 稀释成众种稀释倍数 ? 有利于众项主意测定 ? 使浓度正在轨范弧线的中心点 ? 有利于创造滋扰 ? 有利于提防污染 才智验证体验及基质效应 定容 要推敲溶剂的结婚。 测定 每个样品测定2?3次,同时领悟轨范参 加物质并领悟加标样品。 数据治理 ? 查看校准弧线是否契合央浼 ? 确定是差别质地数测定结果是否不异 尽量差别逾越轨范弧线的规模,如逾越应稀释 后测定。 才智验证体验及基质效应 基质效应成因 ? 待测组分与基质中内源性物质共洗脱而惹起的色谱柱超载所致, 这些因素常因正在色谱领悟中与宗旨化合物分手不十足或未被检测 到而进入质谱后出现基质效应。 ? 待测组分与生物样品中的基质因素正在雾滴外面离子化进程中的竞 争。因为基质中某些滋扰组分的存正在会使待测组分手子天生的速 度同轨范样品比拟有明显差别,使得信号相应值出现较大变异。 ? 离子的有用淌度受到界限离子的影响,由其界限离子所造成的包 围圈,称为离子基体。假如样品组分从进样点到探测点转移进程 中,正在某偶然间间隔遇上一个差别构成的基体区带,这个离子基 体区带就将对样品组分出现影响,使它们的淌度发作瞬时改变, 从而采用性地影响溶质的转移和分手,这便是瞬时离子基体效应。 ? 分为离子遏抑和离子加强 才智验证体验及基质效应 基质效应的评判: 1.用活动相配制高中低三个浓度的待测物,并插手内标, 测得相应值。 2.空缺基质提取后插手不异浓度的待测物和内标,测响 应值。 基质效应 =空缺基质相应值/活动相相应值×100% 云云差别浓度的待测物的基质效应和内标的基质效应均 可获得。 才智验证体验及基质效应 基质效应打消手段 1.采用符合的样品制备手段,对付差别的样品制 备手段,不行纯粹地说某种手段优于另一种手段, 每种组分对基质效应的敏锐度差别,其适宜采用 的样品制备手段也差别,要通过试验来确定。2. 改良色谱领悟条目:采用反相色谱分手,合意地 填补待测组分的保存时光;删除进样体积; 3.优化质谱领悟条目,源的采用 4.采用内标。 5.基质结婚定量 仪器庇护 ? 一、LC泵: ? 利用buffer后的洗涤。 ? 2、泵120L 活动相(或渗漏)时转换活塞密封 圈,洗涤液从部件中渗漏转换活塞。 ? 3、流速错误,或RT不稳时转换wash seal,柱 压过高时转换line filter frit,流速不稳或有气 泡时转换活动相瓶中的filter,drain valve排泄 溶剂时转换转换drain valve O-ring ? 4、泵不行启动时转换保障丝 仪器庇护 ? 二、主动进样器: ? 1、检讨管途及贯串处(查漏),跑一针轨范 品。 ? 2、转换转子密封圈,转换the flush solvent inlet filter转换针座。 ? 3、洗涤针或堵了的管线,转换syringe,转换 进样环 ? 4、洗涤、润滑syringe驱动体例,洗涤、润滑 xyz arm,校正xyz体例。 仪器庇护 ? 三、质谱: ? 1、每周洗涤管途及API源,洗涤Ion sweep cone和离子传输通道。取下离子传输通道洗涤, 转换离子传输通道。 ? 2、APCI/ESI源:sample tube分裂、断绝或增 长时转换sample tube,割短sample tube。 ? 3、散热电扇:洗涤电扇过滤器。洗涤防尘罩。 仪器庇护 ? 四、死板泵: ? 1、每天检讨泵油。检讨死板泵体温度。 ? 2、加油、换油。 ? 五、除尘防锈,庇护USP电源。